В годы Великой Отечественной войны музей перенес все тяготы тылового города. В начале войны музей, как и другие учреждения, перешел на режим военного времени. Сотрудники увольнялись в связи с уходом в Красную армию, им на смену приходили люди, эвакуированные из европейской части России (Москва, Ленинград, Воронеж, Латвия), не имевшие опыта музейной работы.
Помещение использовалось музеем менее чем наполовину. Согласно решению Барнаульского горсовета от 06.05.1942 г. в здание Алтайского краевого музея переселилась Краевая детская техническая станция, здесь размещалось общежитие ремесленного училища трудового резерва, жили люди. Постоянная экспозиция была частично свернута.
Музей работает, несмотря на трудности военного времени. В 1943 г. в музее были созданы стационарные выставки: «25 лет Красной армии», «Великая Отечественная война советского народа с немецкими захватчиками», «Сибиряки-алтайцы на фронтах Великой Отечественной войны», «Тыл – фронту», «Лекарственные растения Алтайского края», «Комсомольцы Алтая в дни войны». В основную экспозицию «Великая Отечественная война» регулярно вводились свежие сводки Информбюро. Алтайским краевым музеем в 1943 г. было приготовлено 63 выставки-передвижки по 30 различным военным, историческим и сельскохозяйственным темам и показаны более чем в 90 пунктах: по районам края, в госпиталях, на призывных пунктах и военных училищах, в драмтеатре.
Первостепенной задачей стал сбор и изучение материалов по Великой Отечественной войне и по связанной с ней исключительной героике тыла. Первый экспонат – немецкий эрзац-валенок – прислал с Западного фронта боец 5-й гвардейской дивизии, бывший рабочий прядильной фабрики Барнаула В. Блюменталь. 12 августа 1942 г. Артиллерийский музей Красной Армии передал Алтайскому краевому музею целую коллекцию (131 ед. хр.). В условиях военного времени не менее важным было выявление и изучение местных природных богатств и ресурсов края для мобилизации их на оборону Родины. Тема Великой Отечественной войны в комплектовании Алтайского государственного краеведческого музея сохранилась на все последующие десятилетия.
Интересный факт! На опытном ботаническом участке, существовшем при музее, сотрудники выращивали лекарственные растения, кукурузу, свеклу, изучали влияние удобрений на растения. В годы войны сад был дополнен яблонями, грушами, местными сортами вишни, сливы, малины, смородины, крыжовника. Вся свободная площадь участка была занята под картофель. Музейный участок помогал эвакуированным сотрудникам выжить. Кроме того, работники музея участвовали в лесозаготовках, уборочных кампаниях, строительстве моста через р. Обь. В 1941 г. коллектив Алтайского краевого музея на собрании решил отчислять в фонд обороны страны до окончания войны однодневный заработок ежемесячно.
В 1942 г. за первые полгода Алтайский краевой музей посетило 14032 человека, в 1943 г. – 23300, в 1944 г. – 17140, в 1945 г. музей навещало лишь 5-9 человек в день.
После окончания Великой Отечественной войны Алтайский краевой музей был закрыт для переоборудования и реорганизации музея. Только 1 мая 1946 г. были открыты отделы природы и соцстроительства. Проводимый 27 мая 1946 г. в Барнауле юбилей 180-летия со дня смерти Ивана Ивановича Ползунова стал датой открытия экспозиции «Историческое прошлое Алтая». Она показывала основные этапы развития техники и важнейшие исторические события, происходившие в ХVIII в. В другом зале были представлены темы: «Алтайский горный округ ХIХ в.», «Исследователи Алтая», «Революционная деятельность подпольных организаций РСДРП в Барнауле в 1905-1912 гг. и Февральская революция 1917 г.».